Popova tình nguyện trở thành một phi công quân sự, nhưng chính phủ ban đầu cấm phụ nữ tham gia các vị trí chiến đấu và từ chối bà.[2] Nhưng vào tháng 10 năm 1941, Joseph Stalin, do những nỗ lực vận động của Marina Raskova, đã cho phép thành lập ba trung đoàn hàng không nữ.[2]

Popova, với mối thù người anh trai Leonid đã hy sinh ở mặt trận năm 1941 và quê nhà của họ đã bị quân Đức chiếm,[2] được Marina Raskova gửi đến Engels để tham gia cùng những phụ nữ khác được đào tạo để trở thành phi công quân sự. Sau đó, bà tham gia một trung đoàn ném bom đêm, và thăng tiến lên vị trí chỉ huy Trung đoàn phụ nữ thứ 2 (1941-1945),[8] bay trên chiếc Polikarpov Po-2, một chiếc máy bay hai tầng cánh, vốn được sử dụng để phun thuốc nông nghiệp trước chiến tranh. Trung đoàn phi công nữ luôn bay vào ban đêm; những chiếc máy bay của họ, không được trang bị súng, radio, radar hoặc dù, sẽ thiêu hủy ngay lập tức nếu bị trúng đạn dù chỉ là tối thiểu.[2]

Vào ngày 10 tháng 3 năm 1942, trong một nhiệm vụ huấn luyện, Popova đang dẫn đầu đội hình thì có hai máy bay bị lạc trong trận bão tuyết dữ dội và bị rơi, làm toàn bộ phi hành đoàn thiệt mạng. Đây là những thương vong đầu tiên trong đơn vị của bà.[7] Sau khi hoàn thành huấn luyện, bà được cử đi chiến đấu tại khu vực quê hương thời thơ ấu của mình trên các mỏ than Donetsk. Trung đoàn của bà được quân Đức gọi là "Nachthexen" (Phù thủy đêm) bởi tiếng ồn ào của chiếc máy bay bằng gỗ dán và vải của họ khiến người Đức nhớ đến tiếng chổi của phù thủy." [2]

Popova từng bị bắn hạ nhiều lần trong ba năm chiến đấu, nhưng không bao giờ bà bị thương nặng.[2] Vào ngày 2 tháng 8 năm 1942, khi bà đang thực hiện nhiệm vụ trinh sát ban ngày thì bị các phi công Luftwaffe tấn công và buộc phải hạ cánh khẩn cấp gần Cherkessk. Trong khi đang cố gắng tìm cách trở về đơn vị của mình, bà đi nhờ một đoàn xe cơ giới, và gặp được người chồng tương lai của mình trong số các thương binh, phi công chiến đấu Semyon Kharlamov, người đang đọc Sông Đông êm đềm.[7]

Sau đó, bà tiếp tục thực hiện một nhiệm vụ tiếp tế xuyên qua hỏa lực của kẻ thù đang bao vây Novorossiysk, thả lương thực, nước uống và vật tư y tế cho các lực lượng bị mắc kẹt ở Malaya Zemlya, một nhiệm vụ gần như bất khả thi. Sau khi trở về, bà mới nhận ra chiếc máy bay của mình bị thủng lỗ chỗ đạn, ngay trên cả bản đồ và mũ bay của bà.[7][9]

Khi các lực lượng phe Trục bắt đầu rút lui, đơn vị của Popova đã đi theo mặt trận qua Belarus và Ba Lan và cuối cùng vào Đức. Chính tại ở Ba Lan, bà đã đạt được kỷ lục cá nhân của mình khi thực hiện 18 phi vụ chỉ trong một đêm.[7] Tổng cộng, Popova đã hoàn thành 852 phi vụ trong chiến tranh.[3]